明膠酶譜分析試劑盒

MMP-2&MMP-9明膠酶譜(pu)法(fa)檢測試(shi)劑盒說明書

1. 簡介：

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原(yuan)形式分泌，活化后能(neng)夠(gou)降解(jie)細胞(bao)外基質(zhi)的膠原(yuan)蛋(dan)白，又稱膠原(yuan)酶。通過(guo)影響細胞(bao)外基質(zhi)，膠原(yuan)酶參與(yu)胚胎發(fa)育、形態發(fa)生、組織重塑等過(guo)程(cheng)，并(bing)參與(yu)炎癥、腫(zhong)瘤、心(xin)血(xue)管、神經等許多疾病過(guo)程(cheng)。血(xue)漿與(yu)組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guo)程，其在(zai)診斷和治療中的意義日益受到重(zhong)視。

2. 檢測原(yuan)理：

本(ben)試(shi)劑盒采(cai)用(yong)酶譜(pu)法(Zymography)檢測(ce)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的(de)、基于SDS-PAGE 電泳和反(fan)相凝膠染(ran)色的蛋白(bai)酶檢測方法，其(qi)靈(ling)敏度(du)可達1 nM，高(gao)于ELISA方法，其(qi)基本原(yuan)理1和程序是：制備加有膠原酶(mei)底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶(mei)(mei)的(de)樣品在此凝膠中進(jin)行電泳，電泳結束后取出凝膠與酶(mei)(mei)反應Buffer 孵(fu)育，凝膠(jiao)(jiao)染色(se)(se)與(yu)脫色(se)(se)。凝膠(jiao)(jiao)中(zhong)由于含底物(wu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)而(er)被深(shen)染，形(xing)成深(shen)色(se)(se)背景，但(dan)在有(you)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶條帶的位(wei)置，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶將降(jiang)解凝膠(jiao)(jiao)中(zhong)的底物(wu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，因而(er)不被染色(se)(se)而(er)形(xing)成透亮區(qu)域，從(cong)而(er)能同時指示(shi)MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶(mei)學反應緩沖液，可檢測(ce)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜(pu)及活性(xing)，檢測靈敏度~1nM。試劑盒(he)可進行50次標準小(xiao)膠(jiao)檢(jian)測，如果小(xiao)膠(jiao)加樣孔(kong)為10~15個，則總計可檢測500~750個樣(yang)品。

3. 檢(jian)測(ce)目的:

本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜(pu)及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。

4.  試劑盒組成與儲(chu)存：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸(zheng)餾水(shui)稀釋；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸(zheng)餾水稀釋；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考(kao)馬(ma)斯亮藍染色(se)液(ye), 4 oC。

5.檢(jian)測步驟(zou)：

5.1 制(zhi)備含(han)MMP底(di)物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照(zhao)標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 oC 加(jia)熱5分鐘。分別(bie)在濃縮膠和(he)分離膠中額外(wai)加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加(jia)入過硫(liu)酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用(yong)完后可(ke)自行(xing)配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混(hun)合后(hou)直接上(shang)樣。切勿加熱(re)變性，并且僅使用不加還原劑的上(shang)樣緩(huan)沖液。可通過(guo)預(yu)試驗確定加樣量，使用普通蛋白預(yu)染Marker 即可。

陽性對照(zhao)(可選步驟(zou))：可取人、小鼠、大鼠或(huo)兔(tu)100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體(ti)積(ji)混合，取5-15μl 上(shang)樣(yang)。

注：因(yin)為全血成分復雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照

5.3 低(di)電流恒流電泳，每一(yi)塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

5.4 洗滌凝(ning)膠(jiao)：取出(chu)凝(ning)膠(jiao)，去除濃縮膠(jiao)，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝(ning)膠(jiao)，然(ran)后加(jia)入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾(liu)水稀釋)，室(shi)溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5.5 孵育：倒掉(diao)Buffer A。加入(ru)10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或(huo)37oC 孵育1~5 小(xiao)時。陽性對照或者血(xue)中(zhong)的MMP 通(tong)常37oC 孵(fu)育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間(jian)為(wei)10小(xiao)時或(huo)過(guo)夜(ye)。

5.6 顯色(se)：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠(jiao)蛋白質(zhi)考(kao)馬斯亮藍染色液（操(cao)作步驟見(jian)后(hou)面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區(qu)域被深(shen)染，在有MMP 條帶的位置不被染(ran)色而(er)形成透(tou)亮區(qu)域。

透明(ming)區域的位(wei)置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位(wei)置(酶譜)及活(huo)性(xing)。陽性(xing)對照(zhao)將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置(zhi)出現透明條帶。

5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀(yi)上掃描。雖然(ran)MMP條帶透(tou)明，但(dan)凝膠背景并非真正全黑。解決(jue)辦法：可用非透(tou)射光掃(sao)描，或(huo)用軟(ruan)件(jian)圖像處理程序調整背景顯(xian)示為灰(hui)度顯(xian)示，并盡量設置(zhi)為黑色。MMP 條(tiao)帶則為白(bai)色(se)，這種背(bei)景黑(hei)條(tiao)帶白(bai)的格(ge)式是英文(wen)論文(wen)中zui常見的格(ge)式。

明膠酶譜法試劑盒

6.說(shuo)明：

1. 10 mM 能夠EDTA*抑制MMP活性。

2. 凝膠干(gan)(gan)燥(zao)(zao)：可使用聚丙烯(xi)酰胺(an)凝膠干(gan)(gan)膠裝置室溫快(kuai)速(su)干(gan)(gan)燥(zao)(zao)凝膠，作(zuo)為*記錄保(bao)留。

明膠酶譜分析試劑盒

7.參(can)考文獻(xian)：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

SDS-PAGE 凝(ning)膠(jiao)蛋白(bai)質考馬斯亮藍染色液(ye)說明書

常規考馬斯(si)亮藍(lan)SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗(yan)室常用的凝膠染色方(fang)法。銀染方(fang)法雖然靈敏度高(gao)，但所(suo)需試劑復雜并且(qie)有(you)毒有(you)害，操(cao)作步驟繁(fan)瑣，難以(yi)控制獲得好(hao)的染色效果。

染(ran)色(se)步驟(zou)：

1. 此染色液即(ji)為(wei)工(gong)作液，使用時直接將聚(ju)丙烯酰胺凝(ning)膠放在培養皿(min)中以考馬斯亮藍染色液覆(fu)蓋凝(ning)

膠，并緩慢搖動2h；

2. 傾(qing)去染(ran)色(se)(se)液，用脫色(se)(se)液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋(gai)凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加(jia)入新脫色液進行脫色，直(zhi)至獲(huo)得清晰(xi)的(de)藍色的(de)條帶和干(gan)凈的(de)背(bei)景（通常此過(guo)程需要2～4h，也(ye)可脫色過(guo)夜至清晰的(de)藍(lan)色的(de)條帶(dai)和干凈的(de)背景）；

4. 對(dui)凝(ning)膠(jiao)進行分析和(he)照(zhao)相，凝(ning)膠(jiao)可放置在(zai)7％的乙酸中保存。也(ye)可用凝膠(jiao)干膠(jiao)裝置（P2000）對

凝膠進行(xing)處(chu)理后保存。

安全性：含有甲(jia)醇，無特殊毒性，按一般化學品操作規程處理。

說明：

1. 染色液(ye)配方：0.25g 考馬斯(si)亮藍R250+420ml 甲(jia)醇+100ml 冰乙酸，定容至1000ml，混合1h 后用

Whatman 1 號濾(lv)(lv)紙過(guo)濾(lv)(lv)，于室溫(wen)可無限期保存；

2. 脫色(se)液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰(bing)醋酸；

4. 凝膠染色(se)之后，染色(se)液可(ke)以回收利用，裝入新容器內(nei)，室溫或(huo)4 oC 保存，可(ke)反復使用2-4 次(ci)。

所有產(chan)品僅(jin)供科研使用，不得用于(yu)食(shi)用，醫療(liao)等其它用途(tu)。